OBTENÇÃO DE METÁFASES MITÓTICAS EM PEIXES

(Adaptado do capítulo "Citogenética de Peixes", de Giselle Perazzo, publicado no livro "Psicultura: aspectos relevantes, de autoria de Camargo et al., 2016)

​

O estudo de cromossomos requer células em processo de divisão, especialmente em metáfase, pois é durante esse período do ciclo celular que tais estruturas se tornam individualizadas e no máximo de condensação permitindo análise citogenética.

Ao longo do tempo, foram desenvolvidas diversas técnicas de obtenção de metáfases para os diferentes grupos animais, impulsionadas pelo uso da colchicina e do tratamento hipotônico. A colchicina é um alcaloide com a propriedade de se ligar aos dímeros de tubulinas, cuja polimerização fica impedida, não formando os microtúbulos, componentes dos fusos mitóticos. Desse modo, o tratamento com colchicina impede a progressão do ciclo celular, acumulando células em metáfase. Aliada à colchicina, o tratamento das células com solução hipotônica, geralmente o cloreto de potássio (0,075M), permite a entrada de água na célula, por osmose, sem que ela se rompa, possibilitando melhor dispersão dos cromossomos em metáfase (Kasahara, 2009).

 

Indução ao aumento da taxa mitótica - Adaptado a partir de Ribeiro (2007) e Artoni et al. (2000): A fim de se obter maior número de mitoses, pode-se estimular a proliferação celular por meio de processo inflamatório, causado pela ação de leveduras. Esta etapa não é condição obrigatória para obtenção de metáfases, porém possibilita maior índice mitótico. Inicialmente, deve-se preparar uma solução de indução (0,5g de fermento biológico e 0,5 de açúcar em 7ml de água destilada), a qual deve permanecer incubada em estufa, à 37ºC, por cerca de 20 minutos. Após esse período, injeta-se na região dorsolateral do peixe a solução de indução na proporção de 1ml para cada 100g de peso animal, mantendo-o em aquário por 48 horas. Após esse período, deve-se proceder à obtenção de metáfases, de acordo com o método escolhido.

 

Basicamente, temos dois métodos de obtenção de metáfases: tratamento , através da cultura de tecidos (método indireto) e o tratamento (método direto). Em ambas, o tecido comumente utilizado na citogenética de peixes é o rim, na sua porção cefálica (anterior), pois este órgão apresenta atividade hematopoiética em peixes, consequentemente com taxa mitótica mais elevada.

 

Tratamento in vitro – método indireto - Adaptado a partir de Fenocchio et al. (1991): Neste método é as células são submetidas a um meio de cultura para proliferação celular, podendo ser utilizado RPMI acrescido de 20% de soro bovino fetal. O meio de cultura deve ser preparado em meio estéril (fluxo laminar), podendo permanecer congelado até seu uso. Inicialmente, a porção anterior do rim do peixe deve ser transferida para um recipiente com aproximadamente 5ml do meio de cultura, no qual se procede com a fragmentação do tecido, com auxílio de pinças, e a homogeneização através de aspirações suaves com uma seringa. A solução obtida deve ser incubada em estufa (27ºC - 30ºC), por um período de 7 a 8 horas. Cerca de 25 minutos antes do término do período de incubação, devem ser adicionadas à solução, 3 gotas de colchicina (0,025%) para interromper as divisões celulares, agitando suavemente o recipiente e mantendo-o em estufa até o término da incubação. Após esse período, a solução deverá ser centrifugada por 10 minutos a 800-900 rpm e descartado o sobrenadante. Ao pellet formado deve ser adicionada 8 ml solução hipotônica (KCl 0,075M), ressuspendido o material com suaves e repetidas aspirações (em torno de 30) e mantido em estufa, à 37ºC, por 30 minutos para hipotonização.

Durante este período é aconselhável preparar o fixador o qual deve ser sempre preparado na hora de uso e mantido refrigerado. Usualmente, utiliza-se metanol e ácido acético na proporção de 3:1. Transcorrido o período de hipotonização, deve-se pingar cerca de 5 gotas do fixador recém preparado, ressuspender o material suavemente e novamente centrifugá-lo, por 10 minutos a 800 – 900 rpm. Ao término da centrifugação, descarta-se o sobrenadante, adiciona-se 8ml do fixador gelado, ressuspende-se o material, o centrifuga-o por igual período e rotação. Procede-se, então, a mais uma rodada de fixação, repetindo-se o descarte de sobrenadante, adição de fixador, ressuspensão de material e centrifugação. Terminada as etapas de fixação após três rodadas de centrifugação, o sobrenadante é descartado e 1,5 – 2ml de fixador é adicionado ao pellet que, após ressuspensão, pode ser transferido para tubos plásticos e armazenados em freezer à -20ºC até o momento de preparação das lâminas.

 

Tratamento in vivo – método direto - Adaptado a partir de Bertollo et al. (1978): No método direto, não há cultura celular e a colchicina (0,025) é injetada diretamente no peixe, na região intraperitoneal, na proporção de 1ml para cada 100g de peso corporal, mantendo-se o animal em aquário por período de 50 – 60 minutos. Transcorrido esse período, o animal deve ser anestesiado e sacrificado, retirando-se a porção anterior do seu rim e colocando-a em 10ml solução hipotônica (KCl 0,075M). Esse material deve então ser fragmentado com auxílio de pinças e homogeneizado com suaves aspirações através de seringa, para em seguida proceder ao período de hipotonização, com incubação em estufa à 37ºC por cerca de 30 minutos.

Terminada a hipotonização, a próxima etapa é a de fixação, a qual é idêntica àquela do método indireto. À solução após incubação em estufa, adicionam-se algumas gotas de fixador (novo), ressuspende-se o material, centrifuga-o e descarta-se o sobrenadante. Novo fixador é adicionado e realizada mais uma etapa de centrifugação, que se repete por mais uma vez (ver detalhes no item método indireto). Ao final, após o descarte do sobrenadante, adiciona-se 1,5 – 2ml de fixador e armazena-se o material à -20ºC até a preparação de lâminas.

 

Preparação de lâminas, coloração convencional e visualização

Com o material citogenético preparado, procede-se à preparação das lâminas microscópicas para visualização das metáfases e análise cromossômica, bem como para execução de diversas técnicas de marcadores cromossômicos. O material deve ser pingado em lâminas previamente limpas e com a superfície aquecida, para que o choque térmico (material gelado x superfície quente) e físico (distância entre a pipeta e a lâmina) propicie o rompimento das membranas e dispersão das metáfases pela lâmina. Duas gotas geralmente são suficientes para a análise citogenética, de modo que o material restante retornar ao armazenamento à -20ºC, sendo utilizado novamente quando necessária nova preparação de lâmina. Depois de pingado o material, as lâminas devem secar totalmente, estando disponíveis para coloração.

A coloração convencional na citogenética de vertebrados usualmente é realizada através do emprego do corante Giemsa (azur-eosina-azul de metileno) (Kasahara, 2009). Em peixes, utiliza-se a concentração de 5% (diluído em tampão fosfato - pH 6,8), submergindo-se as lâminas por cerca de 10 minutos. Logo após, as lâminas devem ser lavadas com água destilada e secas naturalmente, estando disponíveis para análise microscópica.

Para cada exemplar, o pesquisador deve analisar uma quantidade que permita estabelecer o número modal de cromossomos do indivíduo, uma vez que podem ocorrem variações esporádicas na quantidade de cromossomos entre as metáfases. Geralmente, de 20 – 30 metáfases são suficientes, sendo indicada análise em maior aumento (100x). Aquelas metáfases com melhor dispersão e morfologia devem ser fotografadas para posterior montagem de cariótipo.